GST pull-down

利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合實現，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結(jié)合傳承，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)（1）證實兩種蛋白可能有相互作用（2）尋找能與已知蛋白發(fā)生相互作用的未知蛋白表現明顯更佳。

GST pull-down實驗方法原理

利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合狀態，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結(jié)合。因此指導，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復(fù)合物混合時就可被吸附而分離廣泛認同。

GST-pulldown主要包括以下三個部分：①利用基因重組技術(shù)構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的原核表達載體；②通過原核表達系統(tǒng)表達帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白流動性；③利用GST親和純化柱進行蛋白純化獲得高純度的融合蛋白鍛造，再利用GST親和純化柱進行蛋白間的相互作用檢測。

實驗操作程序：

材料及試劑

探針蛋白與GST融合的原核蛋白持續創新，裂解的細胞蛋白改善，或者組織蛋白提取物

細胞蛋白裂解液空白區，洗脫液：PBS及PBS+1%Triton-100

（以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過表達蛋白B相互作用）

1：原核融合蛋白A的獲得

1.1：將編碼蛋白A與GST的重組質(zhì)粒化轉(zhuǎn)BL21(DE3)菌株

1.2：挑取單個克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里信息化，37℃培養(yǎng)過夜

1.3：將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中形勢，37℃，225rpm培養(yǎng)至OD600≈1.0-1.5左右取得明顯成效，加入適當(dāng)濃度的IPTG約定管轄，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間（誘導(dǎo)條件需要根據(jù)不同的蛋白做調(diào)整），6000g創新的技術，10分鐘發揮，4℃離心收集細菌，去盡上清快速增長，將菌體至于-20℃放置O/N

1.4：室溫凍融菌體開放以來，馬上置于冰上，每500ml培養(yǎng)液加入10-20ml細菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF）穩步前行，吹打混勻

1.5：冰上超聲破碎結構不合理，開2秒，停9秒各有優勢，總40-60分鐘效果較好。至裂解液充分清涼

1.6：11000rpm，15分鐘持續，4℃離心分離上清等多個領域， -80℃保存?zhèn)溆?/span>

2：真核融合蛋白B的獲得

2.1：將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標(biāo)簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達載體上，進行細胞轉(zhuǎn)染

3：48小時后產品和服務，取適量融合蛋白GST-A 于冰上凍融

4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中應用擴展，用800ul PBS+1%Triton-100潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻增多，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1小時活動上。

5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次進一步推進。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer導向作用。

6：同時，裂解真核融合蛋白B應用的選擇，去盡培養(yǎng)基十大行動，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例背景下，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier）綜合措施，4℃放置30分鐘。

7：吹打收集至1.5mlEP管自然條件，超聲破碎設計標準。13000rpm開展，15分鐘，4℃離心取上清充分發揮。

8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer發展成就，其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補足液體到600ul左右重要方式，以便蛋白之間能充分結(jié)合開展面對面！4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次非常重要。

10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白進一步提升，煮沸3分鐘，高速離心認為，Run –SDS PAGE做Western Blot檢測系統。用HA或者myc Blot

注意事項：

內(nèi)源性蛋白的干擾使得實驗出現(xiàn)的假陽性結(jié)果較多：

（1）高純度的GST融合蛋白能夠減少實驗的假陽性。由于高純度的融合蛋白能減少實驗結(jié)果的假陽性重要意義，因此獲得高純度的融合蛋白對于GST-pull down 實驗結(jié)果 分析具有重要的作用交流等。同時，為了能夠盡可能的保證融合蛋白原有的生物學(xué)活性規劃，一般在獲取融合蛋白時傾向于可溶性融合蛋白提高，因此獲得高純度的可溶性蛋白很關(guān)鍵。

（2）對于可溶性蛋白的獲得條件主要有①載體的選擇進入當下。②可溶性蛋白表達條件的選擇紮實，③誘導(dǎo)溫度，④誘導(dǎo)時間新體系，⑤誘導(dǎo)物的濃度投入力度，能夠不被細胞代謝而且具有穩(wěn)定的濃度。

毓秀生物科技（上海）有限公司是一家專注于生物科技前沿技術(shù)研發(fā)和科研技術(shù)服務(wù)的公司不難發現，公司建有專業(yè)的分子生物學(xué)貢獻法治、細胞生物學(xué)、組織病理學(xué)實驗室發展需要，為眾多生物醫(yī)藥企業(yè)共享、科研機構(gòu)、醫(yī)院及高校提供分子生物學(xué)方式之一、細胞生物學(xué)、病理形態(tài)學(xué)等方面科研服務(wù)新型儲能。公司核心團隊曾在國內(nèi)外許多優(yōu)秀學(xué)府從事過多年研發(fā)工作創新能力，秉承“為客戶創(chuàng)造價值，為員工實現(xiàn)夢想範圍，為社會創(chuàng)造財富"的經(jīng)營理念求得平衡，堅持以技術(shù)創(chuàng)新為先導(dǎo)紮實做，以服務(wù)質(zhì)量為根本，為中國生物醫(yī)藥和科學(xué)研究提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)至關重要。