外泌體western鑒定

更新時間：2024-09-26

簡要描述：

外泌體western鑒定主要檢測指標(biāo)為CD63首要任務、CD9新技術、CD81、Tsg101傳遞、Alix試驗、HSP70等，針對外泌體的定性檢測提供有力支撐，至少選擇2-3個指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表就可以切實把製度。大部分文獻中沒有檢測內(nèi)參，個別文章中使用了Actin自行開發、GAPDH和Tubulin作為內(nèi)參進行檢測進行部署，外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達豐度相對于正常細胞樣品中的較低應用情況，可能會檢測不到任何條帶或者條帶微弱保護好。

　　外泌體western鑒定主要檢測指標(biāo)為CD63特點、CD9、CD81可能性更大、Tsg101部署安排、Alix、HSP70等技術，針對外泌體的定性檢測推廣開來，至少選擇2-3個指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表就可以。大部分文獻中沒有檢測內(nèi)參相對較高，個別文章中使用了Actin資源配置、GAPDH和Tubulin作為內(nèi)參進行檢測，外泌體中的Actin相關、GAPDH和Tubulin的表達豐度相對于正常細胞樣品中的較低大力發展，可能會檢測不到任何條帶或者條帶微弱豐富內涵。

　　外泌體western鑒定操作步驟大致是：

　　用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2 nm的載樣銅網(wǎng)上產能提升，室溫靜置2 min適應性，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負染5 min總之，濾紙吸干負染液面向，室溫晾干，電鏡觀察拍照研學體驗。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界建設項目、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結(jié)構(gòu)(也會有200 nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體)落實落細，但電鏡對樣品的預(yù)處理和制備要求較高相結合，樣品分離方法和樣品性質(zhì)可能影響電鏡結(jié)果的好壞；樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜製高點項目，不適合對外泌體進行大量快速的測量為產業發展；且因外泌體經(jīng)過了預(yù)處理和制備過程，無法準(zhǔn)確測量有所增加。

　　掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)或透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)等電子顯微鏡可用于外泌體鑒定各項要求。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上越來越重要的位置，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像新技術，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展不要畏懼，場發(fā)射電子槍的應(yīng)用得到普及服務為一體，現(xiàn)代先進的SEM的分辨率已經(jīng)達到1 nm左右，足夠用來進行外泌體尺寸的測量逐漸顯現。TEM是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上全會精神，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射拓展基地。散射角的大小與樣品的密度集中展示、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像體系流動性，影像放大探索創新、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片積極拓展新的領域、感光耦合組件)上顯示出來配套設備。

　　以上兩種方法是常用的外泌體的鑒定方法更優質，是展開外泌體功能研究的前提相對開放。比如在腫瘤研究中推進高水平，通過提取鑒定不同細胞系中的外泌體，進而通過PCR以及測序篩選分析RNA拓展應用，探究外泌體在腫瘤進展或者耐藥中的發(fā)生機制生產創效。